产品货号：
GS2297
中文名称：
2×TaqMan Fast qPCR预混液(低ROX)
英文名称：
2×TaqMan Fast qPCR Master Mix(Low Rox)
产品规格：
1mL|5mL
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种即用型的PCR反应预混合液，含有快速热启动Taq DNA酶、MgSO4、dNTP Mix和一些稳定剂。提供的2X Master Mix含有除引物、模板和探针外的所有组分，用于快速探针法实时定量PCR。热启动Taq DNA酶和独有的缓冲系统，在实时qPCR过程中减少了引物二聚体的形成，增强了扩增产物的特异性和检测的灵敏度。
DNF Buffer专用于存在多个非特异性扩增位点的引物。对于一些没有很好引物的DNA序列，DNF Buffer可根据下列方法加入到反应体系中。
| 组分 | 1mL | 5mL |
| 2×TaqMan Fast qPCR预混液(低ROX) | 1mL | 1mL×5 |
| DNF Buffer | 200μL | 1mL |
| Sterilized ddH2O | 1mL | 1mL×5 |
保存：-20℃，避免反复冻融。
ROX参考染料在2×TaqMan Fast qPCR预混液(低ROX)中为100 nM，适用于需要用低浓度ROX参考染料进行校正的实时PCR仪器，如Applied Biosystems 7500，Applied Biosystems 7500 Fast，Stratagene Mx3000P®，Stratagene Mx3005P™，Stratagene Mx4000™，Applied Biosystems ViiA 7 and Applied Biosystems QuantStudio™12K Flex。
- 配制反应体系
- 溶解并混匀各组分，短暂离心；
- 根据下表准备反应体系：
注意：DNF Buffer只加入到引物存在多个非特异扩增位点的反应混合液中。普通引物勿加。成分 用量 终浓度 2×TaqMan Fast qPCR预混液(低ROX) 10μL 1× 10μM Forward Primer 0.4μL 200 nM 10μM Reverse Primer 0.4μL 200 nM 10μM probe 0.2～0.4μL 100～200 nM Template DNA As required <250ng DNF Buffer(Optional) 2μL 0.5M PCR-grade water 至20μL -
- 溶解并混匀各组分，短暂离心；
- 运行qPCR
- 根据下列循环程序使用两步法运行qPCR：
步骤 温度 持续时间 循环数 预变性 94℃ 3min 1 变性 94℃ 5s 40 退火/延伸/数据采集 60℃ 30s - 如果引物最适退火温度不在60～65℃左右，根据下列循环程序使用三步法运行qPCR
步骤 温度 持续时间 循环数 预变性 94℃ 3min 1 变性 94℃ 5s 40 退火 最适退火温度 15s 延伸/数据采集 72℃ 30s
- 根据下列循环程序使用两步法运行qPCR：
| 问题 | 可能原因 | 建议 |
| 荧光强度低或无 | 探针标记不上 | 重新合成探针 |
| 无目的扩增产物 | 始终使用纯化过的高质量完整DNA作为模板。琼脂糖凝胶电泳分析模板完整性；确保引物可用。 循环程序缺乏必要步骤，检查循环程序。 | |
| 引物浓度过低 | 使用引物中浓度为0.1～0.5μM。 | |
| 光通道不适合探针 | 根据标记的探针选择正确的光通道。 | |
| 无模板的对照组出现阳性信号(NTC) | 污染 | 扔掉所有试剂，清洗所有移液枪及其表面，准备新鲜的引物贮备液等。 |
| 荧光信号增加迟 | 起始模板低 | 提高模板DNA的量。 |
| 退火温度过高 | 利用梯度优化退火温度 | |
| 引物或探针浓度过低 | 提高引物浓度。200 nM探针浓度通常已经足够。 |
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